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cck8試劑實(shí)驗(yàn)過程中的疑難解答(二)
點(diǎn)擊次數(shù):7849 更新時(shí)間:2018-03-22
1.哪些物質(zhì)會影響cck8試劑的測定?
當(dāng)有還原性物質(zhì)存在時(shí)會影響CCK8的測定,例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。
2.在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高,如果不能減少細(xì)胞數(shù)量,如何解決?
可以縮短加入CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。
3.設(shè)定參比波長的目的是什么?必須設(shè)定嗎?
不一定要設(shè)定。cck8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。
4.說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應(yīng)該加多少量cck8試劑?
一般情況下建議加入cck8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。
5.在cck8試劑顯色過程中,如何終止反應(yīng)?
有一下幾種方法(96孔板): 1、 在顯色反應(yīng)后,將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應(yīng)停止后,應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測定。
6.必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎?
不一定。如果要向保持細(xì)胞的狀態(tài),建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng),細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng),但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時(shí)需要統(tǒng)一檢測條件。
7.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?
金屬對cck8試劑顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑制。
8.cck8試劑的保存條件?
在避光條件下cck8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時(shí)間的話,推薦在-20℃下保存。但是cck8試劑若反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結(jié)果,若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。
9.預(yù)培養(yǎng)后,更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎?
一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細(xì)胞,用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù),制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話,可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。
10.cck8試劑對于不同的細(xì)胞,靈敏度是否一樣?
不一樣,懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對于貼壁細(xì)胞,一般加入cck8試劑培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高,但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低,可以通過延長cck8試劑的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。
11.懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別?
懸浮細(xì)胞由于染色比較困那,一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易,若細(xì)胞數(shù)量過大,有時(shí)吸光度會超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。
12.應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎?
建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的,但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣,對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞,建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對于不同的批號建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
13.有時(shí)在藥物作用情況下,細(xì)胞已經(jīng)死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量?
不能。由于cck8試劑是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量,如果細(xì)胞已經(jīng)死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細(xì)胞數(shù)量將會比真實(shí)值高,不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量,建議采用別的方法測定。
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